动态生物样品的三维观测在基础研究与技术应用中具有深远意义。以海洋生态系统为例，解析浮游生物（如桡足类、纤毛虫等）的三维运动模式，对理解海洋生态系统的变化以及环境变化对海洋浮游生物的影响具有至关重要的作用。
光场显微成像（Light-field microscopy）通过捕获四维光场信息（二维空间+二维角度数据），结合计算重建算法实现非扫描式三维成像。利用光场显微成像技术对动态生物过程观测需要进一步引入第五维度——时间，获取五维数据（二维空间+二维角度+一维时间）。当前主流的光场显微成像技术在实现五维数据获取方面面临显著局限性（图1）：基于微透镜阵列的光场显微成像（MLA-based light-field microscopy）以牺牲空间分辨率为代价换取高时间分辨率；图像编码光场显微成像（Image-coding-based light-field microscopy）虽然具有高的角度分辨率，但存在时间分辨率和空间分辨率相互制约的矛盾；孔径编码光场显微成像（Aperture-coding-based light-field microscopy）虽然具有高的空间分辨率，但存在时间分辨率和角度分辨率相互制约的问题。空间分辨率是衡量显微成像的关键技术指标，如何在不损失空间分辨率的情况下，提升时间分辨率，成为光场显微成像亟待解决的关键问题。
图1.不同光场显微成像技术的权衡策略比较。（a）基于微透镜阵列的光场显微成像；（b）图像编码光场显微成像；（c）孔径编码光场显微成像
2.研究内容
近期，暨南大学钟金钢课题组联合中科院深圳先进技术研究院李剑平课题组在Advanced Imaging期刊发表题为“Differential high-speed aperture-coding light field microscopy for dynamic sample observation with enhanced contrast”的研究论文。该研究提出了一种差分高速孔径编码光场显微成像技术，通过优化孔径编码、图像获取速率以及光场重建算法，在不牺牲空间分辨率的前提下，显著提高了光场成像的时间分辨率和成像对比度，为动态样品的观测提供了一种全新的解决方案。
成像系统的光路设计如图2所示，其中图2（a）是主成像光路，空间光调制器位于傅里叶透镜的后焦面，用于对傅里叶谱图像进行编码。相机在像面捕获调制后的二维强度图像（空间信息），其每个像素可视为独立的单像素探测器。研究采用单像素成像方法重建频谱图像（角度信息）。单像素成像遵循亥姆赫兹互异性原理，空间光调制器的作用相当于对偶光路（图2（b））中的虚拟相机，而相机的作用则相当于虚拟空间光调制器。利用单像素成像技术重建的对偶图像相当于对偶光路中的虚拟相机捕获的图像。因此，该系统能够同时利用真实相机获取待测样品的空间信息，以及利用虚拟相机获取角度信息，从而有效解决角度和空间分辨率相互制约的难题。
图2.差分高速孔径编码光场显微成像的原理示意图。（a）主成像光路；（b）对偶成像光路
3.技术突破和主要创新点
论文的亮点主要集中在以下三个方面：
（1）高速孔径编码与图像获取，突破光场成像的时空分辨率限制
传统孔径编码光场显微技术面临时空分辨率的矛盾。为了解决这一难题，本研究采用高速空间光调制器在傅里叶平面对傅里叶谱图像进行快速编码。同时，使用高速相机，实现编码图像的快速捕获。这种高速编码与图像获取的协同机制，显著提升了光场成像的时间分辨率，为动态过程的实时观测提供了技术保障。
（2）差分编码策略，有效提升光场图像的对比度
针对孔径编码光场显微技术中难以避免的直流背景噪声，本研究提出了一种差分编码策略。该策略通过在空间光调制器上加载一组相移的傅里叶基底图案，并利用差分单像素成像算法，有效消除相机记录的直流背景噪声，从而提高光场图像的对比度。图3对比展示了使用差分编码策略和未使用该策略（基于S矩阵的孔径编码光场显微成像）重建的光场图像。实验结果表明，采用差分编码策略重建的图像对比度是基于S矩阵的孔径编码光场显微成像的2倍，充分证明了该策略在提升图像质量方面的优势。
图3.本文所提方法与基于S矩阵的孔径编码光场显微成像方法的性能比较
（3）采用欠采样策略，实现时间分辨率的有效提升
利用频谱图像所具有的能量积聚特性，提出欠采样策略，在不牺牲空间分辨率和景深的前提下，提高光场成像的时间分辨率。实验结果表明（图4），在60%的采样率下，重建的光场图像在景深和空间分辨率方面与采样率为100%下重建的光场图像相当。值得一提的是，本文提出的方法在欠采样时无需使用复杂的迭代优化算法，这不仅简化了计算流程，也提高成像效率，为动态观察提供了可能。
图4.本文所提方法在不同采样率下的性能比较
4.应用
为了验证本文所提方法的有效性和可行性，我们将其应用于动态桡足样品的成像实验。实验采用数值孔径为0.3，放大倍率为10的物镜，重建的光场容积为。空间光调制器和相机的帧率均设置为1340Hz。图5展示了宽场显微术与本文方法在不同采样率下的成像效果对比。
实验结果表明，在100%采样率下，重建光场需要53次测量，获得的时间分辨率为25Hz，当采样率降低至60%时，测量次数减少至32次，时间分辨率显著提升至41Hz，且成像质量几乎不变。这一发现证实，通过适当降低采样率，可以在保持成像质量的同时有效提升光场成像的时间分辨率。这一特性为动态生物样品的观测提供了新的技术途径。
图5.动态桡足样品的成像结果。（a1-e1）传统的宽场显微术；（a2-e2）采样率为100%时采用本文方法获取的结果；（a3-e3）采样率60%时采用本文方法获取的结果
5.结论与展望
本文提出了一种差分高速孔径编码光场显微成像方法，通过使用差分编码策略，将光场成像结果的对比度相对基于S矩阵的孔径编码光场显微术提升了两倍。此外，借助高速空间光调制器和高速相机，并结合欠采样机制，可以在不牺牲空间分辨率的前提下，显著提升了孔径编码光场显微成像的时间分辨率。通过进一步优化编码方案，使用更高帧率的空间光调制器和相机，有望进一步提高光场的时间分辨率。本文提出的方法为动态样品的观测提供了一种全新的解决方案。
作者简介
彭军政，工学博士，副研究员。主要从事计算光学成像、光场显微成像、光学三维传感、机器视觉等方面的研究。主持并参与国家自然科学基金青年项目和面上项目、广东省自然科学基金面上项目等项目多项。先后在Advanced Imaging, APL Photonics, Optics Express, Applied Physics Letters,光学学报等国内外学术期刊发表学术论文多篇, 其中2篇论文入选Optics Express 封面论文，1篇论文被美国光学学会以“Image of the Week”形式进行报道。曾获2021年度广东省自然科学奖二等奖（排名第三）。
李剑平，博士，中国科学院深圳先进技术研究院正高级工程师，中国科学院大学博士生导师，深圳市海洋声光探测技术及装备工程研究中心主任。主要从事创新光学方法、先进光电仪器、机器视觉与机器学习在海洋观测中的应用。主持并参与国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院、广东省科技厅、深圳市科技创新委等研究项目。带领团队研制了水下浮游生物成像仪、走航式浮游植物成像流式细胞仪、海水叶绿素a、COD、BOD传感器等多种海洋仪器。在IEEE JOE，ICES JMS, FMARS，ECCV，ICCV， Optics Letters, Optics Express、Applied Optics等知名期刊和国际学术会议发表论文多篇。
图文：彭军政
校对：杨嘉琳
责任编辑：邓玉萌
初审：肖艳芳
复审：孙玉环
终审发布：黄睿